自然杀伤（natureal killer，NK）细胞是先天免疫系统的淋巴细胞，其可以直接识别杀死肿瘤细胞，在抑制癌症发展中起重要作用^[1]。此前的研究数据提示NK细胞在治疗血液肿瘤上具有良好前景^[2-3]。

然而目前关于NK细胞疗法还有许多关键问题尚待解决。比如，当NK细胞和癌细胞互作时两者的基因表达发生了什么变化，上述基因表达变化和癌细胞对NK细胞的敏感性是否受癌细胞遗传特征的影响，以及哪些机制驱动肿瘤对NK细胞产生耐药性。

近日，芬兰赫尔辛基大学医院综合癌症中心Satu Mustjoki团队和美国哈佛大学医学院Constantine S. Mitsiades团队联合在Immunity杂志上发表了题为Single-cell functional genomics reveals determinants of sensitivity and resistance to natural killer cells in blood cancers的文章。该文章利用基于单细胞转录组测序技术（scRNA-seq）、CRISPR筛选技术、CROP-seq等方法，揭示了NK细胞和不同血癌细胞互作时两者的基因表达变化情况，并发现影响癌细胞对NK细胞敏感性的机制是多样的。

首先，作者探究了NK细胞和癌细胞互作时两者的基因表达变化。作者使用了26种不同血癌的细胞系，具体涉及急性和慢性粒细胞白血病（AML和CML）、B细胞和T细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL和T-ALL）、B淋巴瘤（BCL）和多发性骨髓瘤（MM）等血癌。其将这些细胞系单独培养或与供体来源的离体扩增/未扩增NK细胞共培养24h，然后使用scRNA-seq对细胞培养物（共193个样本）进行了多时间点检测。

结果显示，离体扩增的NK细胞可以被分为5个簇（Cluster）。其中，单独培养的NK细胞主要属于静息NK细胞（Cluster 0）和适应性NK细胞（Cluster 1）。而与肿瘤细胞共培养的NK细胞，则主要属于Cluster2-4：Cluster 2为激活态NK细胞（高表达共刺激受体基因、共抑制受体基因、死亡受体配体基因等）；Cluster 3高表达1型干扰素（IFN-1）信号通路相关基因；Cluster 4高表达细胞因子。

进一步的探究表明，不同的癌症细胞系会引起NK细胞发生不同的表达变化。如，IFN-1高表达状态仅由某些癌细胞系诱导产生；与B-ALL相比，NK细胞针对BCL、T-ALL、AML和CML的反应更强。未扩增的NK细胞表现出类似的结果。

此外，作者还分析了不同时间点NK细胞的状态变化。结果表明，静息NK细胞在与癌细胞共培养1小时后先转变为高表达细胞因子状态，随后步入早期激活态，后进入激活态，最后进入IFN-1状态。

随后，作者探究了遭受NK细胞攻击后癌细胞转录组的变化。结果显示，NK细胞的攻击诱导癌细胞产生了强烈IFN-γ反应，尤其是在T-ALL、AML和CML中。此外，在超过50%的癌细胞系中，MHC-1复合体相关、MHC-1肽装载、JAK-STAT信号通路、免疫蛋白酶体等相关基因均显著上调。

NK细胞和癌细胞的转录组变化在患者样本中也得到了验证。上述结果表明，NK细胞与癌细胞互作时，NK细胞和癌细胞转录组变化情况取决于癌细胞类型。

接着，作者使用一种分子条形码方法——PRISM（profiling relative inhibition simultaneously in mixtures）量化了63个不同血液肿瘤细胞系对原代NK细胞的剂量依赖敏感性，以探究不同谱系和成熟阶段的癌细胞对NK细胞的敏感性。

结果显示，不同癌细胞对NK细胞的敏感性存在显著差异。AMK和B-ALL细胞分别是最敏感和最不敏感的。MM细胞相对不敏感，而T-ALL细胞相对敏感，但是两者均呈现出显著变异，表明两组细胞中存在敏感和耐受亚组。此外，敏感性还与转变为激活态/IFN-I状态的NK细胞百分比呈正相关。

进一步作者使用CRISPR筛选技术进行了基因组规模的功能丧失和功能获得筛选，以探究癌细胞对NK细胞敏感性和耐受性背后的潜在机制。结果显示，MHC-I复合体和抗原呈递机制相关基因的丧失增加了所有癌细胞系对NK细胞的敏感性。而死亡受体途径相关基因的缺失增加了癌细胞对NK细胞的耐受性。同时，CRISPR筛选结果还揭示了一系列以前未被充分认识的基因会影响NK细胞对癌细胞的杀伤作用，比如许多转录调节因子、蛋白岩藻糖基化基因（如FUT8、GMDS）、粘附相关的糖蛋白基因（如SPN）等。

作者还利用公开数据库对CRSIPR筛选技术获得的关键基因进行了验证。结果发现体细胞突变发生在MHC-I复合体亚基基因B2M、NF-kB信号基因、转录因子、表观遗传修饰因子、CD2配体CD58以及外源性凋亡介导因子CASP8等区域，表明CRSIPR筛选结果的可靠性。

随后，作者对CRIPSR筛选结果与PRISM结果进行了联合分析，以确定CRISPR筛选结果是否可以有效解释不同癌细胞系对NK细胞敏感性不同。结果显示，两者的结果能够相互印证。

此外，分析结果还揭示了TRAF3和WHSC1基因表达情况会影响MM对NK细胞的敏感性，PVR和ULBP1的表达（受甲基化调控）会影响T-ALL对NK细胞的敏感性，而在BCL中，生发中心B细胞对NK细胞的敏感性最强，这与GNA13等一系列基因相关。

然后，作者使用CROP-seq技术进一步揭示CRISPR技术筛选出的最关键的65个基因如何帮助癌细胞逃避NK细胞的“攻击”。作者比较了受到扰动的细胞和带有对照sgRNA的细胞之间的基因表达情况，发现有65个基因中有30个基因的扰动没有明显影响癌细胞的整体表达，其中包括许多细胞表面蛋白（如SELPLG、SPN、MUC1等），提示癌细胞与NK细胞的物理接触是介导这些基因影响癌细胞对NK细胞敏感性的关键。

进一步作者探究了剩余明显会改变癌细胞基因整体表达的35个基因的CROP-seq结果。聚类结果显示，35个基因中，IFN-γ信号相关的基因和NF-kB信号通路相关的基因分别聚成了一簇。此外，还发现有些基因可能是通过影响MHC-1和IFN-γ相关基因的表达来影响癌细胞对NK细胞的敏感性。

最后作者利用单细胞转录组数据，探究了干扰癌细胞中CRISPR筛选出的基因是否会影响NK细胞转变为激活状态。结果表明，能够诱导癌细胞产生耐受性的干扰确实降低了NK细胞的激活评分，并阻止NK细胞转变为激活状态。反之，能够诱导癌细胞变敏感的干扰能够让NK细胞激活。

综上，该研究全面探索了NK细胞和血液肿瘤细胞相互作用中的基因表达谱变化，以及影响癌细胞对NK细胞敏感性和耐受性的潜在分子机制。该研究为NK细胞疗法提供了丰富的数据资源。

（来源：BioArt）

参考文献：

1. Chiossone, L., Dumas, P.-Y., Vienne, M., and Vivier, E. (2018). Natural killer cells and other innate lymphoid cells in cancer. Nat. Rev. Immunol. 18, 671–688.

2.Myers,J.A.,andMiller,J.S.(2021).Exploring the NK cellplatformforcan-cer immunotherapy. Nat. Rev. Clin. Oncol. 18, 85–100.

3. Shimasaki, N., Jain, A., and Campana, D. (2020). NK cells for cancer immunotherapy. Nat. Rev. Drug Discov. 19, 200–218.

链接： https://doi.org/10.1016/j.immuni.2023.11.008